人体内的氨是蛋白质代谢过程中通过氨基酸脱氨基,肾脏使谷氨酰胺分解和肠道内细菌的作用而生成。大部分氨在肝内通过鸟氨酸循环合成尿素。一部分被用于酮酸的氨基化,合成谷氨酰胺,在肾内形成铵盐从尿中排出。血氨在诊断治疗肝昏迷、肝性脑病中占重要地位,尿中氨测定是估价体内酸碱平衡紊乱的指标之一,血氨的测定方法有离子交换树脂法、直接法、电极法及酶法,其中酶法以其简单、特异性高而被广泛应用。
正常范围:18~72μmolL。
增高:见于肝昏迷、重症肝炎、肝肿瘤、休克、尿毒症、有机磷中毒、先天性高氨血症及婴儿暂时性高氨血症。
减低:见于低蛋白饮食、贫血等。
(1)各试剂成分的终浓度:磷酸盐540mmol/L,α-酮戊二酸10mmol/L,NAD-PH120μmol/L,ADP0.5mmol/L,GLDH16U/ml。
(2)酶法测定血浆氨具有特异、简便、快速等优点,且可上自动分析仪。腺苷二磷酸(ADP)可稳定GLDH,增强反应速率。NADPH作辅酶较NADH可缩短反应时间,但前者价格更贵。
(3)血浆中LDH、AST等也可利用NAD(P)H而产生内源性的消耗,直接影响血浆氨测定结果,起动剂α-酮戊二酸加入前37℃加温10min为NAD(P)H内源性消耗反应时间。
(4)血浆氨测定的准确性在很大程度上取决于标本收集是否符合要求。用EDTA·Na2抗凝,静脉采血与抗凝剂充分混匀后立即置冰水中,尽快分离血浆,加塞置2~4℃保存,在2~3h内分析;-20℃可稳定24h,显著溶血者不能用,因红细胞中氨浓度为血浆的2.8倍。
(5)线性范围0~150μmol/L,日常工作中可仅用100μmol/L标准应用液。
(6)如测定值超出线性范围,可用去氨水稀释血浆后重作。
(7)血氨含量甚微,要防止环境及所用各种器皿中氨的影响。
(8)国内已有血浆氨酶法测定试剂盒,请按说明书操作。如中生公司的试剂盒,用三乙醇胺缓冲液,NADPH作辅酶,NADPH内源性消耗反应在室温中需反应20min。
取材:血液
血氨的测定原理:血浆氨的酶法测定基于下列反应:
在过量α-酮戊二酸、NAD(P)H和足量谷氨酸脱氢脱氢酶(GLDH)条件下,酶促反应的速率,即NAD(P)H转变成NAD(P)+使340nm吸光度的下降速率与反应体系中氨的浓度呈正比关系。
试剂:全部试剂必须用去氨水制备。去氨水用蒸馏水经氢型阳离子交换树脂处理获得。
(1)66.7mmol/LKH2PO4溶液:取9.12gKH2PO4溶入去氨水中,定溶到1L,4℃保存。
(2)66.7mmol/LNa2HPO4溶液:取9.51gNa2HPO4溶解并加去氨水到1L,4℃保存。
(3)pH8.0(±0.05),66.7mmol/L磷酸盐缓冲液(PB):取5ml“1”液及95ml“2”液,混合,4℃保存,稳定3周。
(4)310mmol/Lα-酮戊二酸:取0.45gα-酮戊二酸,溶于5ml去氨水中,用3mol/L氢氧化钠调pH至接近5.0时,改用0.1mol/L氢氧化钠调pH至6.8(±0.01),切勿调得过碱,因高pH可破坏α-酮戊二酸,以去氨水稀释到10ml,4℃稳定10天;
(5)NADPH贮存液:称约10mgN-ADPH(-20℃、干燥器保存)溶于1mlPB中取出50μl,以PB稀释到5ml为工作液,以PB调零,1cm光径,在340nm波长读NADPH工作液的吸光度,计算NADPH贮存液中实际浓度:
6.22为NADPH的毫摩尔吸光系数,据上式计算结果确定制备GLDH工作液中加入NADPH贮存液的量,使达到149μmol/L。
(6)GLDH工作液:根据GLDH酶制品(-20℃干燥器中保存)的比活,称出酶活力为992U的相应量(如比活为50U/mg蛋白,则称20mg),如GLDH在甘油中,可按U/ml吸出992U的相应体积,置50ml量瓶中,称入ADP(-20℃,干燥器中保存)15mg,吸入计算量的NADPH贮存液,以PB稀释到50ml,4℃保存可稳定7天;
(7)氨标准贮存液,100mmol/L:称取(NH4)2SO4660.7mg,溶于去氨水定容到100ml,4℃保存;
(8)氨标准应用液:用去氨水分别稀释贮存液成25、50、100、及150μmol/L。
操作方法:所用分光光度计需配有37℃恒温比色系统及340nm波长。如用自动分析仪,可根据本法反应条件自行设计,样品及试剂用量按比例减少。操作见表1,按B、S、U管先后顺序进行。
混匀,于10s时读A10s于70s时读A70s,求各管的△A,即△A=A10s-A70s。
一般无禁忌人群。
1、感染:采集血液时注意无菌操作,采血处避免水液等污染,以免局部感染。
2、出血:采血后给予充分按压时间,尤其有凝血障碍,出血倾向者,避免局部皮下渗血,淤青肿胀。