流式细胞DNA分析临床意义:

流式细胞仪的临床应用:1.流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡;2.流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞(CD34+)计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测;3.流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。异常结果：有资料表示对71例胸腔积液做流式细胞DNA分析，结果显示，对恶性胸腔积液诊断的敏感性为52%，特异性达100%。若与常规检查联合应用，则可使诊断的敏感性达到94%。癌性胸水细胞的DNA分析可见异倍体和S期、G2/M期细胞比例增高。

需要检查的人群：疑似有癌性胸水等相关疾病者

流式细胞DNA分析注意事项：

流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

(一)流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制

流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：

(1)确保标本上机检测前的浓度为1X106细胞/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。

(2)使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

(3)荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

(4)设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

(5)判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

(6)注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。

(二)DNA倍体分析的质量控制仍没有统一的标准，各文献报道的实验结果差异较大，1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA测定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。

(1)手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。

(2)标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。

(3)固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。

(4)单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。

(5)细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106细胞/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现10%的漂移。

(4)DNA倍体标准的质量控制，采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。

流式细胞DNA分析检查过程：

流式细胞DNA分析：直接用可产生荧光的核酸染料(如碘化丙啶)对胸水中细胞进行染色，流式细胞仪分析胸水细胞的DNA含量、细胞周期分布和DNA倍体数.

流式细胞术常规检测时的样品制备:

(一)直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1X106细胞/ml)，直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，孵育20～60分钟后，用PBS(pH7.2～7.4)洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

流式细胞DNA分析不适宜人群：

无。