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鉴别方法为取患者少许抗凝血在小三角瓶中摇，如血很快变为鲜红，表明血中含有较多还原血红蛋白;如血不能变红，则可肯定血中仍有其他异常血红蛋白。肉眼观察时高铁血红蛋白呈现巧克力样的棕褐色，硫化血红蛋白呈蓝褐色，血红蛋白M则因生成高铁血红蛋白而呈巧克力棕褐色。以蒸馏水稀释血液10～20倍，加入硫化铵或1%氰化钾数滴，如为高铁血红蛋白则由棕褐色变为鲜红色;如时间过久，则变为蓝褐色(高铁血红蛋白-氧合血红蛋白-硫化血红蛋白);如颜色不变鲜红色则为硫化血红蛋白。分光镜下观察高铁血红蛋白之吸收光带在波长618～630nm处，硫化血红蛋白在波长607～620nm处;加入硫化铵或氰化钾后高铁血红蛋白之吸收光带消失，而硫化血红蛋白之吸收光带不变(因硫化血红蛋白一旦生成即不能再还原)。至于遗传性高铁血红蛋白血症与HbM的鉴别为二者遗传方式不同;高铁血红蛋白血症为隐性常染色体遗传，HbM为显性常染色体遗传，后者的血红蛋白电泳时有异常区带而前者则否。
硫化血红蛋白常常易被误诊为高铁血红蛋白，因临床表现非常相似，需认真进行实验室检查。