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1.病原学检查将可疑食物、呕吐物或排泄物加热煮沸20min后，接种血琼脂作厌氧菌培养，检出致病菌。对创伤型肉毒中毒，在血清中找到毒素或从伤口处分离并在厌氧条件下培养出肉毒杆菌可明确诊断.婴儿型肉毒中毒需与脓毒症，先天性肌营养不良，脊柱肌肉萎缩，甲状腺功能减退及良性先天性肌张力减低相鉴别.在粪便中找到肉毒毒素或该菌可确诊！
2.毒素试验
(1)动物试验：将检查标本浸出液饲喂动物，或作豚鼠、小白鼠腹腔内注射，同时设对照组，以加热80℃30min处理的标本或加注混合型肉毒抗毒素于标本中，如试验组动物发生肢体麻痹死亡，而对照组无，则本病的诊断即可成立。
(2)中和试验：将各型抗毒素血清0.5ml注射小白鼠腹腔内，随后接种标本0.5ml，同时设对照组，从而判断毒素和定型。
(3)禽眼接种试验：将含有毒素的浸出液，视禽类大小，采用0.1～0.3ml不等注入家禽眼内角下方眼睑皮下，出现眼睑闭合，或出现麻痹性瘫痪和呼吸困难，经数十分钟至数小时死亡，可作为快速诊断。
3.肌电图检查有肌纤维颤动，单次刺激反应降低，多次反复刺激电势反而增高，有短持续期小波幅多相运动、电势增加等特点，有助于本病诊断。