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根据病史和临床表现怀疑真菌性巩膜炎应立即进行实验室检查。角膜或巩膜区刮片行革兰染色或姬姆萨(Giemsa)染色可显示真菌的形态(有隔膜的菌丝碎片)，革兰染色检出率约55%，姬姆萨染色检出率约66%。确诊需培养出真菌。培养真菌需时较长，为提高培养的阳性率，同时接种几种不同的培养基。常用的真菌培养基如萨布罗葡萄糖琼脂适合真菌生长;血琼脂培养基适宜多数酵母菌;二态真菌在37℃孵箱中生长;巧克力琼脂、心-脑浸出液(brain-heartinfusion,BHI)、Löwenstein培养基适宜抗酸真菌生长;Thioglycolate培养基适宜分枝杆菌生长。用2个培养盘：一个在室温下培养，另一个在35℃常规培养真菌。
如果角膜发生匐行性改变，有真菌性角巩膜炎的临床表现，真菌培养和巩膜或角巩膜活检阴性，对广谱抗生素治疗无效，真菌可通过完整的Descemet膜侵入前房，引起前房积脓，角膜尚未穿孔时行前房穿刺，立即用血琼脂或SDA、或BHI室温培养，以确定真菌。但前房穿刺时的创口可能将细菌等微生物接种于前房，必须慎重。
若首先临床疑诊真菌感染，但染色或培养(48h)阴性，早期广谱抗微生物治疗无效，则需作巩膜或角巩膜小片状病灶组织切除活检。可在手术显微镜下切除包括结膜或角巩膜、表层巩膜和筋膜囊病灶组织。一半送往微生物实验室，将组织碎片放入1ml肉汤中混匀，一滴样本用不同的培养基包括在室温下的血琼脂、SDA、BHI单独培养真菌;另一半浸入甲醛送往病理实验室用PAS、GMS、CFW特殊染色，以确定真菌。